Relatório de Bioquímica – Dosagem de Glicose

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Coordenadoria de Biotecnologia Curso de Bioqu?¡mica Pr?ítica: Dosagem de Glicose: M?®todo do DNS e A?º??cares Redutores Alunas: Juliana Esteves Patr?¡cia Sbano Renata Gudergues Ryanna Rubstein Turma: Fm 161 Professores: Rafael Mesquita e Renato Carvalho Data da realiza?º?úo da pr?ítica: 03/11/2010 Data da entrega di relat??rio: 17/11/2011

I. Introdu?º?úo: Os glic?¡dios s?úo macromol?®culas bioqu?¡micas que desempenham as mais diversas fun?º?Áes, como reserva de energia, fun?º?Áes estruturais, podem ser co-fatores enzim?íticos, carreadores de el?®trons, pigmentos, emulsificantes e mensageiros intracelulares, al?®m de Os glic?¡dios podem ser classificados em nos seguintesd grupos: triacilglicer??is, Os carboidratos, tamb?®m chamados de a?º??cares, abrangem um dos maiores grupos de compostos org?ónicos conhecidos na natureza, e juntamente com as prote?¡nas formam os principais constituintes dos organismos vivos, al?®m de servirem, assim como os glic?¡dios, de fonte de energia, estando maior abund?óncia, para o homem. Apresentam estrutura de alde?¡dos ou cetonas com hidroxilas ligadas aos carbonos ao longo da mol?®cula. Estes, quando presentes nas c?®lulas, geralmente se associam ?á outras mol?®culas, como lip?¡dios ou prote?¡nas, formando glicoconjugados. Al?®m disso, em alguns carboidratos ?® poss?¡vel Podem receber tr?¬s classifica?º?Áes, levando-se em considera?º?úo o seu tamanho; Monossacar?¡dios, carboidratos simples que n?úo podem ser hidrolisados a a?ºucares de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialde?¡dos) e cetoses (poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o n??mero de carbonos na cadeia. Em solu?º?Áes, monossacar?¡deos de cinco ou mais ?ítomos de carbono ocorrem como estruturas c?¡clicas. A forma?º?úo do anel d?í-se pela rea?º?úo hemiacetal, isto ?®, quando a carbonila reage com a hidroxila do carbono 5 formando uma liga?º?úo hemiacetal, essa rea?º?úo gera dois estereois??meros diferentes em rela?º?úo ao carbono 1, eles s?úo designados ? ou ? dependendo da dire?º?úo rota?º?úo espec?¡fica. Oligossacar?¡dios, pol?¡meros compostos de res?¡duos de monossacr?¡dios unidos por liga?º?Áes hemiacet?ílicas, neste caso denominadas liga?º?Áes O-glicos?¡dicas, em n??mero que variam de duas, at?®, aproximadamente, dez unidades. S?úo compostos importantes na Polissacar?¡dios, macromol?®culas facilmente encontradas na natureza e que ocorrem em quase todos organismos exercendo diversas fun?º?Áes. Formam-se a partir das liga?º?Áes glicos?¡dicas geralmente com mais de 10 unidades de monossacar?¡dios ou seus derivados. As unidades monossacar?¡dias mais decorrentes s?úo: D-glucose, D-manose, D- Os monossacar?¡deos podem ser oxidados por agentes oxidantes su?íveis como os 3+ 2+ ?¡ons Fe e Cu , em que o carbono do grupo carbonila ?® oxidado a carboxila. Os a?º??cares capazes de reduzir um destes dois ?¡ons s?úo chamados de a?º??cares redutores. A propriedade redutora ?® dada pelo n??mero de enedi??is formados na solu?º?úo. Para o glic?¡dio formar enedi??is ?® necess?írio que tenha sua hidroxila heteros?¡dica livre, podendo passar da estrutura c?¡clica para estrutura aberta. Uma vez oxidado, o enediol leva o azul de metileno a se reduzir para azul de leucometileno que ?® incolor. Com a agita?º?úo do tubo, o oxig?¬nio presente no ar Esta caracter?¡stica ?® a base da rea?º?úo de Fehling utilizada para detectar a presen?ºa destes a?º??cares e tamb?®m determinar a concentra?º?úo do mesmo, atrav?®s da medida da O m?®todo do DNS ?® um m?®todo utilizado na dosagem de a?º??cares redutores onde ocorre a oxida?º?úo do grupo carbonila. O oxidante, chamado DNS utiliza o ?ícido dinitro- salic?¡lico; sal de Rochelle, (solu?º?úo de t?írtaro de s??dio de pot?íssio) que serve para prevenir o reagente da a?º?úo do oxig?¬nio dissolvido; fenol, que ?® utilizado para aumentar a quantidade de cor produzida; bissulfito, que ?® um estabilizante da cor obtida na presen?ºa do fenol; hidr??xido de s??dio, que ?® o redutor da a?º?úo da glicose sobre o ?ícido dinitro-salic?¡lico. Ocorre no m?®todo do DNS a seguinte rea?º?úo de oxida?º?úo:. Ocorre neste caso a redu?º?úo do 3,5-di-nitrosalicitato (de cor amarelo forte) ?ícido e a oxida?º?úo do monossacar?¡deo, formando o 3-amino-5nitro-salicilato (de cor laranja-marrom forte), na propor?º?úo estequiom?®trica. Portanto, pela determina?º?úo da luz absorvida a 540nm pelo 3-amino-5nitrosalicilato, pode- se determinar a concentra?º?úo de a?º??car redutor presente na solu?º?úo.

II. Objetivos: Dosagem de Glicose: M?®todo do DNS A?º??cares Redutores:

III A. Material: Dosagem de Glicose: M?®todo do DNS A?º??cares Redutores: III B. M?®todos: Dosagem de Glicose : M?®todo do DNS Com o aux?¡lio de pipeta e pr??-pipete, foram transferidas al?¡quotas das solu?º?Áes reagentes para os tubos de ensaio enumerados, conforme a tabela abaixo: Tubo no ?ügua Destilada Solu?º?úo Padr?úo Solu?º?úo Glicose Solu?º?úo DNS de Glicose 10 mM [?] Desconhecida B 1,0 – – 1,0 1 0,8 0,2 – 1,0 2 0,6 0,4 – 1,0 3 0,4 0,6 – 1,0 4 0,2 0,8 – 1,0 5 – 1,0 – 1,0 6 – – 1,0 1,0 Ap??s isto, os tubos foram homogeneizados e levados para o aquecimento em banho- maria ?á 100??C durante 5 minutos. Esperou-se os tubos esfriarem, as solu?º?Áes contidas neles foram transferidas para tubos de ensaio maiores, e assim acrescentados 13 mL de ?ígua a cada um dos tubos, obtendo ent?úo, um volume final de 15 mL em todos eles. Tampou-se com Parafilm e homogeneizou-se com o aux?¡lio de um v??rtex. Em seguida, a solu?º?úo que continha neles foi tranferida para cubetas e levadas para a leitura espectrofotom?®trica da absorb?óncia a 540 nM, utilizando o tubo branco para a calibra?º?úo do aparelho.

A?º??cares redutores Com o auxilio de pipeta e pr??-pipete foram transferidas al?¡quotas das solu?º?Áes reagentes para os tubos de ensaio enumerados, conforme a tabela abaixo:

Os tubos foram vedados com Parafil e homogeneizados. Ap??s isto, foram incubados ?á temperatura ambiente e os resultados obtidos foram observados.

IV. Resultados: Dosagem de Glicose: M?®todo do DNS Ap??s a realiza?º?úo dos procedimentos especificados no roteiro de pr?ítica, obtivemos os seguintes resultados de absorb?óncia:

o Tubo n ?ügua Destilada Solu?º?úo Solu?º?úo Glicose Solu?º?úo DNS Abs. Padr?úo de [?] Glicose 10 mM Desconhecida B 1,0 – – 1,0 0 1 0,8 0,2 – 1,0 0,178 2 0,6 0,4 – 1,0 0,383 3 0,4 0,6 – 1,0 0,579 4 0,2 0,8 – 1,0 0,807 5 – 1,0 – 1,0 0,966 6 – – 1,0 1,0 0,292 A partir do valor da absorb?óncia e da concentra?º?úo de cada tubo, conseguimos desenhar uma curva padr?úo da glicose e, assim, calcular o valor da concentra?º?úo de glicose desconhecida.

– C?ílculos para obten?º?úo da quantidade de glicose em cada tubo: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Tubo 5 A partir do gr?ífico constru?¡do, achamos a equa?º?úo da reta em fun?º?úo da absorb?óncia e da massa de PNP

Como a reta passa pela origem, e como y representa o valor da absorb?óncia e x a massa, temos:

a pode ser calculado com a utiliza?º?úo de dois pontos da reta:

Dessa forma, a concentra?º?úo de glicose desconhecida ser?í de:

A?º??cares Redutores: Ap??s a incuba?º?úo dos tubos de ensaio ?á temperatura ambiente, observou-se que a colora?º?úo dos tubos 2 e 4 permaneceu azul escura e a do tubo 2 apresentava um azul mais claro. O tubo 1 tornou-se incolor, sendo que, ao ser agitado, tornava-se azul mas logo voltava a ser incolor.

V. Discuss?úo: Dosagem de Glicose: M?®todo do DNS O m?®todo do DNS se fundamenta na redu?º?úo do ?ícido 3,5-dinitro salic?¡lico em ?ícido 3- amino-5-nitro salic?¡lico por conta da a?º?úo de a?º??cares redutores. Dessa forma, a D-glicose foi utilizada e se oxidou, resultando em ?ícido D-gluc??nico, de acordo com a rea?º?úo abaixo:

Ao medirmos as absorb?óncias foi poss?¡vel notar que esses valores s?úo diretamente proporcionais ?ás concentra?º?Áes de glicose obtida em cada tubo. Isto ocorre porque, quanto maior a concentra?º?úo de glicose, maior ser?í a forma?º?úo do ?ícido 3-amino-5nitro salic?¡lico, que ?® o respons?ível pela cor alaranjada das solu?º?Áes e, consequentemente, pelas medidas de A partir deste m?®todo n?úo ?® poss?¡vel dosar a sacarose, pois este heteropolissacar?¡deo n?úo apresenta carbono anom?®rico livre para ser oxidado, ou seja, os carbonos anom?®ricos da sacarose encontram-se como constituintes da liga?º?úo glicos?¡dica entre suas subunidades S?? seria poss?¡vel dosar a sacarose pelo m?®todo do DNS se a liga?º?úo glicos?¡dica fosse desfeita por alguma altera?º?úo no meio ou pela a?º?úo de algum reagente. Deste modo, ter?¡amos as concentra?º?Áes das subunidades e poder?¡amos relacion?í-las, atrav?®s de c?ílculos, ?á concentra?º?úo da sacarose.

A?º??cares Redutores: Os a?º??cares redutores s?úo aqueles que possuem o carbono anom?®rico livre e s?úo capazes de reduzir ?¡ons de Prata e de Cobre em solu?º?úo alcalina, logo todos os monossacar?¡deos s?úo redutores. Essa propriedade de alguns glic?¡dios est?í relacionada ?á forma?º?úo da estrutura enediol, que ?® uma fun?º?úo altamente redutora em meio alcalino A glicose, em meio alcalino, rapidamente se transforma em enediol, uma estrutura intermedi?íria que leva a forma?º?úo de D-frutose e D-manose. No tubo 1, uma vez oxidado, o enediol reduz o azul de metileno a azul de leucometileno que ?® incolor. Quando o tubo de ensaio ?® agitado, o oxig?¬nio presente no ar age na solu?º?úo oxidando o azul de leucometileno e assim reduz a D-glicose, e a solu?º?úo se torna azul escura, por?®m logo ap??s a agita?º?úo sessar esta torna-se incolor novamente, pois o oxig?¬nio proveniente do ar n?úo reage mais com a solu?º?úo, e o azul de metileno ?® novamente reduzido. No tubo 2, provavelmente houve alguma forma?º?úo de enediol que reduziu um pouco do azul de metileno ?á azul de leucometileno, tornando a solu?º?úo azul mais clara. J?í que a solu?º?úo n?úo era alcalina, pois nela n?úo foi adicionada a base NaOH, n?úo houve uma forma?º?úo muito grande de enediol. O tubo 2, ao qual havia sido adicionada a sacarose, permaneceu na mesma colora?º?úo do tubo que n?úo recebeu glic?¡dio algum, isto se d?í pois a sacarose n?úo ?® um a?º??car redutor, uma vez que seu cabono anom?®rico est?í envolvido na liga?º?úo glicos?¡dica, logo n?úo est?í livre. Sendo assim, a sacarose, mesmo em meio alcalino, n?úo ?® capaz de formar enediol e o indicador ?á azul de metileno n?úo ?® reduzido.

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