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Relatório de Bioquímica - Dosagem de Glicose

Coordenadoria de Biotecnologia Curso de Bioquímica Prática: Dosagem de Glicose: Método do DNS e Açúcares Redutores Alunas: Juliana Esteves Patrícia Sbano Renata Gudergues Ryanna Rubstein Turma: Fm 161 Professores: Rafael Mesquita e Renato Carvalho Data da realização da prática: 03/11/2010 Data da entrega di relatório: 17/11/2011

I. Introdução: Os glicídios são macromoléculas bioquímicas que desempenham as mais diversas funções, como reserva de energia, funções estruturais, podem ser co-fatores enzimáticos, carreadores de elétrons, pigmentos, emulsificantes e mensageiros intracelulares, além de Os glicídios podem ser classificados em nos seguintesd grupos: triacilgliceróis, Os carboidratos, também chamados de açúcares, abrangem um dos maiores grupos de compostos orgânicos conhecidos na natureza, e juntamente com as proteínas formam os principais constituintes dos organismos vivos, além de servirem, assim como os glicídios, de fonte de energia, estando maior abundância, para o homem. Apresentam estrutura de aldeídos ou cetonas com hidroxilas ligadas aos carbonos ao longo da molécula. Estes, quando presentes nas células, geralmente se associam à outras moléculas, como lipídios ou proteínas, formando glicoconjugados. Além disso, em alguns carboidratos é possível Podem receber três classificações, levando-se em consideração o seu tamanho; Monossacarídios, carboidratos simples que não podem ser hidrolisados a açucares de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdeídos) e cetoses (poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o número de carbonos na cadeia. Em soluções, monossacarídeos de cinco ou mais átomos de carbono ocorrem como estruturas cíclicas. A formação do anel dá-se pela reação hemiacetal, isto é, quando a carbonila reage com a hidroxila do carbono 5 formando uma ligação hemiacetal, essa reação gera dois estereoisômeros diferentes em relação ao carbono 1, eles são designados ? ou ? dependendo da direção rotação específica. Oligossacarídios, polímeros compostos de resíduos de monossacrídios unidos por ligações hemiacetálicas, neste caso denominadas ligações O-glicosídicas, em número que variam de duas, até, aproximadamente, dez unidades. São compostos importantes na Polissacarídios, macromoléculas facilmente encontradas na natureza e que ocorrem em quase todos organismos exercendo diversas funções. Formam-se a partir das ligações glicosídicas geralmente com mais de 10 unidades de monossacarídios ou seus derivados. As unidades monossacarídias mais decorrentes são: D-glucose, D-manose, D- Os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes suáveis como os 3+ 2+ íons Fe e Cu , em que o carbono do grupo carbonila é oxidado a carboxila. Os açúcares capazes de reduzir um destes dois íons são chamados de açúcares redutores. A propriedade redutora é dada pelo número de enedióis formados na solução. Para o glicídio formar enedióis é necessário que tenha sua hidroxila heterosídica livre, podendo passar da estrutura cíclica para estrutura aberta. Uma vez oxidado, o enediol leva o azul de metileno a se reduzir para azul de leucometileno que é incolor. Com a agitação do tubo, o oxigênio presente no ar Esta característica é a base da reação de Fehling utilizada para detectar a presença destes açúcares e também determinar a concentração do mesmo, através da medida da O método do DNS é um método utilizado na dosagem de açúcares redutores onde ocorre a oxidação do grupo carbonila. O oxidante, chamado DNS utiliza o ácido dinitro- salicílico; sal de Rochelle, (solução de tártaro de sódio de potássio) que serve para prevenir o reagente da ação do oxigênio dissolvido; fenol, que é utilizado para aumentar a quantidade de cor produzida; bissulfito, que é um estabilizante da cor obtida na presença do fenol; hidróxido de sódio, que é o redutor da ação da glicose sobre o ácido dinitro-salicílico. Ocorre no método do DNS a seguinte reação de oxidação:. Ocorre neste caso a redução do 3,5-di-nitrosalicitato (de cor amarelo forte) ácido e a oxidação do monossacarídeo, formando o 3-amino-5nitro-salicilato (de cor laranja-marrom forte), na proporção estequiométrica. Portanto, pela determinação da luz absorvida a 540nm pelo 3-amino-5nitrosalicilato, pode- se determinar a concentração de açúcar redutor presente na solução.

II. Objetivos: Dosagem de Glicose: Método do DNS Açúcares Redutores:

III A. Material: Dosagem de Glicose: Método do DNS Açúcares Redutores: III B. Métodos: Dosagem de Glicose : Método do DNS Com o auxílio de pipeta e pró-pipete, foram transferidas alíquotas das soluções reagentes para os tubos de ensaio enumerados, conforme a tabela abaixo: Tubo no Água Destilada Solução Padrão Solução Glicose Solução DNS de Glicose 10 mM [?] Desconhecida B 1,0 - - 1,0 1 0,8 0,2 - 1,0 2 0,6 0,4 - 1,0 3 0,4 0,6 - 1,0 4 0,2 0,8 - 1,0 5 - 1,0 - 1,0 6 - - 1,0 1,0 Após isto, os tubos foram homogeneizados e levados para o aquecimento em banho- maria à 100ºC durante 5 minutos. Esperou-se os tubos esfriarem, as soluções contidas neles foram transferidas para tubos de ensaio maiores, e assim acrescentados 13 mL de água a cada um dos tubos, obtendo então, um volume final de 15 mL em todos eles. Tampou-se com Parafilm e homogeneizou-se com o auxílio de um vórtex. Em seguida, a solução que continha neles foi tranferida para cubetas e levadas para a leitura espectrofotométrica da absorbância a 540 nM, utilizando o tubo branco para a calibração do aparelho.

Açúcares redutores Com o auxilio de pipeta e pró-pipete foram transferidas alíquotas das soluções reagentes para os tubos de ensaio enumerados, conforme a tabela abaixo:

Os tubos foram vedados com Parafil e homogeneizados. Após isto, foram incubados à temperatura ambiente e os resultados obtidos foram observados.

IV. Resultados: Dosagem de Glicose: Método do DNS Após a realização dos procedimentos especificados no roteiro de prática, obtivemos os seguintes resultados de absorbância:

o Tubo n Água Destilada Solução Solução Glicose Solução DNS Abs. Padrão de [?] Glicose 10 mM Desconhecida B 1,0 - - 1,0 0 1 0,8 0,2 - 1,0 0,178 2 0,6 0,4 - 1,0 0,383 3 0,4 0,6 - 1,0 0,579 4 0,2 0,8 - 1,0 0,807 5 - 1,0 - 1,0 0,966 6 - - 1,0 1,0 0,292 A partir do valor da absorbância e da concentração de cada tubo, conseguimos desenhar uma curva padrão da glicose e, assim, calcular o valor da concentração de glicose desconhecida.

- Cálculos para obtenção da quantidade de glicose em cada tubo: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Tubo 5 A partir do gráfico construído, achamos a equação da reta em função da absorbância e da massa de PNP

Como a reta passa pela origem, e como y representa o valor da absorbância e x a massa, temos:

a pode ser calculado com a utilização de dois pontos da reta:

Dessa forma, a concentração de glicose desconhecida será de:

Açúcares Redutores: Após a incubação dos tubos de ensaio à temperatura ambiente, observou-se que a coloração dos tubos 2 e 4 permaneceu azul escura e a do tubo 2 apresentava um azul mais claro. O tubo 1 tornou-se incolor, sendo que, ao ser agitado, tornava-se azul mas logo voltava a ser incolor.

V. Discussão: Dosagem de Glicose: Método do DNS O método do DNS se fundamenta na redução do ácido 3,5-dinitro salicílico em ácido 3- amino-5-nitro salicílico por conta da ação de açúcares redutores. Dessa forma, a D-glicose foi utilizada e se oxidou, resultando em ácido D-glucônico, de acordo com a reação abaixo:

Ao medirmos as absorbâncias foi possível notar que esses valores são diretamente proporcionais às concentrações de glicose obtida em cada tubo. Isto ocorre porque, quanto maior a concentração de glicose, maior será a formação do ácido 3-amino-5nitro salicílico, que é o responsável pela cor alaranjada das soluções e, consequentemente, pelas medidas de A partir deste método não é possível dosar a sacarose, pois este heteropolissacarídeo não apresenta carbono anomérico livre para ser oxidado, ou seja, os carbonos anoméricos da sacarose encontram-se como constituintes da ligação glicosídica entre suas subunidades Só seria possível dosar a sacarose pelo método do DNS se a ligação glicosídica fosse desfeita por alguma alteração no meio ou pela ação de algum reagente. Deste modo, teríamos as concentrações das subunidades e poderíamos relacioná-las, através de cálculos, à concentração da sacarose.

Açúcares Redutores: Os açúcares redutores são aqueles que possuem o carbono anomérico livre e são capazes de reduzir íons de Prata e de Cobre em solução alcalina, logo todos os monossacarídeos são redutores. Essa propriedade de alguns glicídios está relacionada à formação da estrutura enediol, que é uma função altamente redutora em meio alcalino A glicose, em meio alcalino, rapidamente se transforma em enediol, uma estrutura intermediária que leva a formação de D-frutose e D-manose. No tubo 1, uma vez oxidado, o enediol reduz o azul de metileno a azul de leucometileno que é incolor. Quando o tubo de ensaio é agitado, o oxigênio presente no ar age na solução oxidando o azul de leucometileno e assim reduz a D-glicose, e a solução se torna azul escura, porém logo após a agitação sessar esta torna-se incolor novamente, pois o oxigênio proveniente do ar não reage mais com a solução, e o azul de metileno é novamente reduzido. No tubo 2, provavelmente houve alguma formação de enediol que reduziu um pouco do azul de metileno à azul de leucometileno, tornando a solução azul mais clara. Já que a solução não era alcalina, pois nela não foi adicionada a base NaOH, não houve uma formação muito grande de enediol. O tubo 2, ao qual havia sido adicionada a sacarose, permaneceu na mesma coloração do tubo que não recebeu glicídio algum, isto se dá pois a sacarose não é um açúcar redutor, uma vez que seu cabono anomérico está envolvido na ligação glicosídica, logo não está livre. Sendo assim, a sacarose, mesmo em meio alcalino, não é capaz de formar enediol e o indicador à azul de metileno não é reduzido.

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